DHAR基因在高山松及其亲本种复合体中的功能分化研究

	DHAR基因在高山松及其亲本种复合体中的功能分化研究
其他题名	Functional Divergence of Dehydroascorbate Reductases in Pinus densata,tabuliformis andyunnanensis
	考洪娜
学位类型	硕士
导师	曾庆银 ; 王晓茹
	2011
学位授予单位	中国科学院植物研究所
关键词	高山松油松云南松同倍性杂交物种脱氢抗坏血酸还原酶克隆蛋白表达酶活性分析
摘要	脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR，EC 1.8.5.1）在植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环中发挥重要作用。本论文以同倍性杂交物种高山松以及亲本油松和云南松为材料，利用RT-PCR分别从高山松、油松和云南松中克隆到两个DHAR基因，命名为PdDHAR1和PdDHAR2、PtDHAR1和PtDHAR2以及PyDHAR1和PyDHAR2。我们对这六个基因的序列、编码蛋白的结构与功能进行了比较详细的研究，其主要结果如下： 1、在高山松、油松和云南松中分别克隆得到两组基因：其中PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1的cDNA序列均包括648bp的开放阅读框，编码216个氨基酸的蛋白，预测分子量分别为24.4、24.35和24.35 kDa。PdDHAR2、PtDHAR2和PyDHAR2三个基因的cDNA序列包含681bp的开放阅读框，编码的蛋白包含227个氨基酸，预测分子量分别为26.03、25.96和26.03 kDa。系统发育分析发现三个DHAR1基因是直系同源基因，三个DHAR2基因也是直系同源基因，DHAR1和DHAR2是在陆地植物最近的共同祖先中发生的一次古老基因重复事件产生。高山松在物种形成过程中保留了油松的DHAR1拷贝以及云南松的DHAR2拷贝。蛋白质结构分析表明所有DHAR蛋白均具有典型的谷胱甘肽转移酶结构。三个物种的DHAR蛋白结构高度保守，但DHAR1和DHAR2两组蛋白间在部分区域有构象的变化。 2、通过RT-PCR分析基因表达模式，发现PtDHAR1和PtDHAR2在油松成年植株的叶、芽、根尖、茎韧皮部和根韧皮部以及幼株的根、茎、叶中表达，表明这两个基因是组成型表达基因，在油松的生长发育中可能发挥着重要作用。 3、在大肠杆菌中高效表达并纯化了PdDHAR1、PdDHAR2、PtDHAR1、PtDHAR2和PyDHAR1五个重组蛋白。酶学活性分析显示五个蛋白只对底物DHA具有催化活性，证明这些DHAR蛋白均具有脱氢抗坏血酸还原酶活性。其中PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1对DHA的活性分别为1.492，1.498和0.005μmol/min per mg，而PdDHAR2和PyDHAR2的活性分别为0.388和0.285μmol/min per mg。酶动力学分析发现对第二底物DHA的的KmDHA值都在0.3 - 1.1 mM，预示着DHAR基因对底物DHA有相似的高亲和力。热力学稳定性结果显示PdDHAR2蛋白的热力学稳定性与其他三个蛋白有显著性差异。PdDHAR2蛋白在50℃时还保持着最高活性的87%，而PdDHAR1、PtDHAR1和PtDHAR2在50℃时只剩活性的27%、27%和31%，推测PdDHAR2蛋白是一个热稳定较高的酶，可能在适应高温环境中发挥重要作用。pH依赖性的检测结果显示，DHAR蛋白均在偏碱性的环境中发挥作用，其中PdDHAR2和PtDHAR2在pH 7.5-9.5之间保持着80%以上的相对活力，而PdDHAR1和PtDHAR1的变化范围为7-8，表明前一对基因可能在更广泛的碱性环境中发挥作用。综合系统发育关系、基因表达模式、酶学性质和蛋白质三维结构分析，本论文从不同层次上系统地阐述了杂交起源的高山松基因组中DHAR基因的组成和进化模式：高山松DHAR1基因更类似于油松，而DHAR2基因则更类似于云南松，DHAR基因的选择性继承可能与杂种独特的生态适应性有一定的关联。
页数	52
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.ibcas.ac.cn/handle/2S10CLM1/11851
专题	系统与进化植物学国家重点实验室
作者单位	中国科学院植物研究所
第一作者单位	中国科学院植物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	考洪娜. DHAR基因在高山松及其亲本种复合体中的功能分化研究[D]. 中国科学院植物研究所,2011.

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