IB-CAS  > 中科院植物分子生理学重点实验室
植物细胞物质转运中分泌囊泡动态和胞间连丝组成蛋白的细胞分子生物学研究
Alternative TitleThe dynamics of secretory vesicles and the protein components of plasmodesmata in plant cell macromolecule trafficking
王晓华
Subtype博士
Thesis Advisor林金星 ; 王钦丽
2011
Degree Grantor中国科学院植物研究所
Keyword花粉管 囊泡 隐失波显微镜 扩散系数 胞吐
Abstract细胞内物质转运是一个庞大而复杂的转运系统,囊泡是这一系统中高度动态和可调控的重要运输载体。囊泡转运过程在细胞的增殖和发育过程中具有十分重要的生物学意义,是生命活动的基本事件之一。以往对于囊泡特征和转运的研究,往往是在固定细胞中获得的静态数据,很难在活体状态下对单个囊泡进行追踪和观测分析。一个主要的技术障碍是无法以较高的空间和时间分辨率获得囊泡转运和融合过程中的动力学参数,因而无法揭示每个步骤具体的分子调控机制。因此,急需引入崭新的标记和成像技术对囊泡的快速转运进行实时活体观测及相关动力学特征的研究。 本课题引入单分子研究技术和隐失波荧光成像技术,利用FM4-64 标记白杄花粉管内的分泌囊泡,通过活体状态下对分泌囊泡进行实时动态地追踪,分析花粉管中分泌囊泡转运的动力学参数,以及微丝、微管骨架和高尔基体与囊泡转运之间的动态关系。在隐失波显微镜(evanescent wave microscope, EWM)下,FM4-64 标记的分泌囊泡在白杄花粉管顶端集中分布,其分布模式与被子植物花粉管中的“V”字型不同。与激光共聚焦显微镜下观测到的分泌囊泡集群的分布模式不同,在高时空分辨率的隐失波显微镜下,可以清晰的观测到花粉管顶端区和亚顶端区呈现点状分布的分泌囊泡。 本研究首次实现了植物细胞中对单个囊泡的可视化观测,获得了花粉管内分泌囊泡的动态连续的图像,并进行动力学特征的分析。结果发现:花粉管内囊泡呈现长距离和短距离两种运动,短距离运动囊泡的平均速度为1.09 ± 0.02 μm/s,最高速度为3.5 μm /s,而长距离运动囊泡的平均速度为1.93 ± 0.05 μm/s,最高速度可达5.85 μm/s。此外,对分泌囊泡的运动速度和扩散系数的统计分析后发现,花粉管内分泌囊泡处于规律性的波动状态,并且其运动模式与以前报道的花粉管中囊泡运动呈现自由布朗运动(Brownian motion)相反。 为了进一步检测微丝和微管骨架在花粉管内分泌囊泡转运过程中的作用,我们分别用微丝抑制剂(Latrunculin B 和cytochalasin D)和微管抑制剂(oryzalin 和colchicine)处理花粉管,并对囊泡动力学参数的分析显示。结果显示,微丝骨架的破坏抑制了分泌囊泡的长距离和短距离运动,囊泡被限制在小范围内无法转运;而微管骨架的破坏对分泌囊泡的运动速度和范围影响较小。这些结果说明微丝直接控制花粉管中囊泡的转运,而微管则通过影响微丝的组装间接影响囊泡的转运。 此外在花粉管顶端的近膜区,我们还观察到了由于分泌囊泡与细胞膜融合以及内涵物的释放而引起的荧光信号的逐渐消散,说明胞吐囊泡与细胞膜是完全融合(full-fusion)的。统计结果显示,发现白杄花粉管内并不存在动物细胞胞吐过程中的“kiss-and-run”模型。这一结果无疑暗示植物细胞和动物细胞胞吐过程中膜融合机制可能不同的。 综上所述,本课题的研究取得了以下创新性成果:1)首次在植物活细胞中对单个分泌囊泡进行了可视化和动态追踪,发现白杄花粉管内存在长距离和短距离的运动模式;2)以极性生长的花粉管作为研究体系,开展了胞内分泌囊泡转运的动力学特征的分析,以及微丝、微管骨架对囊泡动态的调节,结果显示分泌囊泡是沿微丝骨架转运并且其运动模式并非布朗运动;3)结合单颗粒追踪技术(single particle tracking, SPT)对分泌囊泡在胞内分布和转运的动力学特征、胞吐过程中膜融合的动力学参数等生物学问题进行了系统的定量分析讨论,通过分析提出了胞吐过程中的“full-fusion”的新模式。利用EWM 我们不仅可以对植物细胞中单个囊泡的运动进行活体动态研究,还可以用来进行细胞器以及单个分子的动态观测,从而为研究细胞生命活动的分子机制提供了新的途径。
Pages132
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.ibcas.ac.cn/handle/2S10CLM1/11913
Collection中科院植物分子生理学重点实验室
Affiliation中国科学院植物研究所
First Author AffilicationInstitute Of Botany,The Chinese Academy Of Cciences
Recommended Citation
GB/T 7714
王晓华. 植物细胞物质转运中分泌囊泡动态和胞间连丝组成蛋白的细胞分子生物学研究[D]. 中国科学院植物研究所,2011.
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