联合固氮菌Enteroabcter gergoviae 57-7氮代谢相关基因的克隆和泌氨工程菌的构建

	联合固氮菌Enteroabcter gergoviae 57-7氮代谢相关基因的克隆和泌氨工程菌的构建
	董越梅
学位类型	博士
导师	朱至清 ; 李久蒂
	1999
学位授予单位	中国科学院植物研究所
学位专业	植物生理学
关键词	日勾维肠杆菌泌氨工程菌谷氨酰胺合成酶基因铵载体基因绿色荧光蛋白基因
摘要	从构建具有稳定泌氨能力的联合固氮工程菌的目的出发，首先构建Enterobacter gergoviae57-7 (E57-7)基因文库并与所筛选的泌氨突变株进行遗传互补实验，得到可互补泌氨特性的克隆，经Southern杂交后推测其中包含与glnA、amtB基因无关的另一类与泌氨相关的基因。同时根据铵载体基因amtB的已知序列设计两对简并性引物，经PCR从 E57-7 DNA中扩增得到约340bp的片段，序列分析和Blast序列同源性比较后确定为amtB 基因片段，申报并获得序列号AJ132232，最终从基因库中筛选到两个包含E57-7 amtB 基因的克隆。用K. pneumoniae的glnA基因片段为探针，通过Southern杂交从E57-7基因库中筛选到包含有glnAntrBC基因的克隆，经亚克隆后对包含有这个操纵元的4316bp片段进行了全序列分析，申报GenBank获得序列号AF072440。在体外实验中构建了Km-cassette 插入glnA的重组质粒pA，将此质粒转入E57-7野生型菌株后经筛选同源重组子获得glnA 突变的具有稳定泌氨能力的菌株15、I9。并进行了盆栽玉米接种实验，确定在灭菌上壤实验体系下I5对玉米幼苗有显著促生效应。利用绿色荧光蛋白(GFP-S65T，V68L，S72A)基因建立分子生物学研究手段，构建了新型克隆载体pGreenLD，建立了绿白斑筛选重组质粒的的技术。构建组成型表达gfp的质粒载体研究了E57-7在玉米根际的定殖模式；构建nifH-gfp表达载体，确定在与植物联合生活时其固氮酶结构基因nifHDK的表达与碳源物质供应密切相关。利用不同抗性基因和gfp基因片段构建出在E57-7中组成型表达抗性和GFP的质粒载体，建立了监测接种菌在土壤中释放的双标记系统。最后克隆了E57-7 glg cluster并测定部分glgCA和glgP基因序列，申报后获得序列号AJ132233和AJ132234，这是首例从联合固氮菌中克隆得到glg cluster的报道。
页数	156
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.ibcas.ac.cn/handle/2S10CLM1/13942
专题	中科院植物分子生理学重点实验室
作者单位	中国科学院植物研究所
第一作者单位	中国科学院植物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	董越梅. 联合固氮菌Enteroabcter gergoviae 57-7氮代谢相关基因的克隆和泌氨工程菌的构建[D]. 中国科学院植物研究所,1999.

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